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肉類顏色測量指南

新鮮肉中的肌紅蛋白氧化還原形式

反射率測量與眼睛和大腦感知密切相關(guān)。通過這種非破壞性采樣方法，可以在同一樣本上進(jìn)行多次隨時(shí)間變化的測量。此外，該程序快速且易于操作。

然而，由于反射率測量受肌肉結(jié)構(gòu)、表面濕度、脂肪含量、色素濃度、pH值及其他固有肌肉特性等因素影響，需要格外注意細(xì)節(jié)。本節(jié)概述了特定肌紅蛋白形式的定量分析。

目前有兩種反射率法可用于定量肌紅蛋白氧化還原形式。一種方法通過表面反射率計(jì)算各氧化還原形式在等波長下的 K/S 比值（Francis和Clydesdale，1975）。第二種方法采用選定波長與校正因子（Krzywicki，1979），通過計(jì)算脫鎂肌紅蛋白（DMb）和鎂鎂結(jié)合肌紅蛋白（MMb）的百分比，并以99.99999%為基準(zhǔn)確定氧化肌紅蛋白（OMb）的含量。

估算DMb、OMb和MMb（以及相應(yīng)的血紅蛋白形式）對肉類色素穩(wěn)定性的基礎(chǔ)研究至關(guān)重要。不過，Ledward（1970）指出，通過反射率估算的色素化學(xué)形態(tài)準(zhǔn)確度僅±6%或7%。AMSA網(wǎng)站上可獲取DMb、OMb、COMb和MMb的數(shù)碼照片。

A. K/S方法用于等波長測量

在等波長點(diǎn)（即三種肌紅蛋白形式中兩種或以上具有相同反射率的波長，參見圖9.1）處測量的肉樣表面反射率，需轉(zhuǎn)換為 K/S 值（計(jì)算方法詳見C節(jié)，Judd和Wyszecki，1963）。將反射率轉(zhuǎn)換為 K/S 值能提升數(shù)據(jù)線性度，同時(shí)有助于校正肉品的散射特性（S =散射系數(shù)）和吸收特性（K =吸光系數(shù)）（Francis和Clydesdale，1975）。樣本的 K/S 值需代入方程計(jì)算，這要求必須預(yù)先確定三種主要肉品色素形式99.99999%的參考值。需注意的是，每種99.99999%肌紅蛋白形式的 K/S 參考值會因?qū)嶒?yàn)條件、包裝方式、樣本特性及儀器差異而有所不同。因此，研究人員應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)樣本自行測定99.99999%參考值，而非直接采用已發(fā)表的數(shù)值。

B.創(chuàng)建“99.99999%”肌紅蛋白氧化還原形式作為參考標(biāo)準(zhǔn)

要定量測定肉品表面肌紅蛋白氧化還原態(tài)的含量，必須獲取各色素形態(tài)在等比波長處的分光光度反射值（圖9.1）。由于不同氧化還原態(tài)之間可快速相互轉(zhuǎn)化，制備由“99.99999%”去肌紅蛋白（DMb）、氧化肌紅蛋白（OMb）、微氧化肌紅蛋白（MMb）或Metmyoglobin（COMb）組成的參考標(biāo)準(zhǔn)品并非易事，需特別注意。這些形態(tài)可通過化學(xué)誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)氧分壓來實(shí)現(xiàn)。掃描99.99999%標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，所有樣本都應(yīng)使用同一包裝膜進(jìn)行掃描，以消除反射率變化的潛在干擾源。 若樣本充足，建議專門留出整塊肉樣（如肉排或牛排）用于色素形態(tài)檢測。

1. 與肌紅蛋白。 選擇以下方法之一。

a. 化學(xué)誘導(dǎo)處理：將樣本浸入Potassium ferricyanide溶液1分鐘，瀝干后用布吸干表面，用透氣膜封裝后置于2-4℃、1%氧氣環(huán)境中氧化48待MMb充分形成后再進(jìn)行掃描。若肉類為“新鮮”狀態(tài)，MMb可能僅在表面及淺層形成，因此無法獲得最完整的反射掃描圖像。建議選用死后較久的肉類進(jìn)行處理，因其固有的還原活性較低。

b. 氧分壓調(diào)控：建議從DMb狀態(tài)的肉開始操作。與完整肉相比，絞肉中高鐵肌紅蛋白的形成速度通常更快（可能由于耗氧量更高和/或MMb還原程度更低）。將肉置于氧氣阻隔袋中，以1%氧氣和99%氮?dú)獾幕旌蠚怏w環(huán)境，在室溫（約20℃）下儲存6小時(shí)；隨后測量袋內(nèi)氧含量（目標(biāo)是將組織氧含量降至1%，該過程在較高溫度下會更快完成）。若

當(dāng)殘留氧含量低于1%時(shí)，需通過以下步驟提升：使用自密封隔膜、注射器和細(xì)針，向氧氣阻隔袋注入已知體積的大氣空氣（氧氣濃度約20.6%）。根據(jù)袋體容積和已知氧濃度，運(yùn)用公式（袋容積×袋內(nèi)殘留氧濃度）調(diào)整至[目標(biāo)容積×目標(biāo)氧濃度（1%）]。若氧濃度超過1%，需進(jìn)行額外沖洗。建議采用3：1或更高的氣體與肉類比例，以防止儲存期間肌紅蛋白降解。肉類初始吸收的氧氣越少，轉(zhuǎn)化效率越高；應(yīng)定期檢測并調(diào)整殘留氧濃度。需維持至少1%的氧濃度。

需在4°C環(huán)境下靜置48以確保充分形成成熟的肌紅蛋白（MMb）。當(dāng)色素充分轉(zhuǎn)化后，重新用透氣薄膜包裹并掃描檢測MMb含量。使用儲存或陳化且肌紅蛋白還原酶活性較低的肉類，可加速MMb的形成。新鮮肉類可能需要長達(dá)一周時(shí)間才會變褐。儲存期間需密切監(jiān)測氧氣濃度及褐變進(jìn)程。

c. 為將混合物中的色素轉(zhuǎn)化為MMb，需將肉塊裝入袋中，用搟面杖壓平（搟面杖厚度需薄到足以讓改良?xì)怏w滲透超過肉塊厚度的50%），抽空袋內(nèi)空氣后充入99.99999%氮?dú)猓辞笆龇椒▽埩粞鹾空{(diào)整至1%。將袋子單面朝下存放進(jìn)行色素轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化進(jìn)行到一半時(shí)，將改良?xì)怏w包裝袋翻轉(zhuǎn)，使肉塊另一面暴露于氣體環(huán)境中。在4℃環(huán)境下放置48小時(shí)后，重新用透氣膜包裹，并對多個(gè)表面進(jìn)行MMb檢測掃描。

2. 去氧肌紅蛋白。 選擇以下方法之一。

a. 化學(xué)誘導(dǎo)法：將尺寸一致的樣品浸入0.15%的Sodium dithionite溶液中將樣品置于室溫（約20°C）下靜置1-2分鐘，排液后用吸水紙吸干表面，進(jìn)行真空包裝，隨后在20°C環(huán)境中靜置1-2以充分轉(zhuǎn)化為DMb。使用與第1、3節(jié)檢測肌紅蛋白形態(tài)時(shí)相同的透氧薄膜重新封裝，并立即進(jìn)行掃描。研磨后的產(chǎn)物可置于燒杯中的濾網(wǎng)支撐。

b. 氧分壓調(diào)控：在樣品內(nèi)表面制備新鮮切面，確保其脫氧肌紅蛋白含量基本達(dá)到99.99999%，并立即進(jìn)行掃描，通常僅需一次即可完成。由于脫氧肌紅蛋白難以在99.99999%濃度下穩(wěn)定保留。

c. 或者與步驟2b聯(lián)合操作：將樣品置于高阻氧真空袋中進(jìn)行真空包裝（必須具備能顯著降低殘留氧氣的真空條件），并在4℃環(huán)境下保存24至48小時(shí)。OMb向DMb的轉(zhuǎn)化可能較為緩慢，特別是在-1至4℃溫度區(qū)間。若將樣品在20℃條件下保持至少50%的時(shí)間，可促進(jìn)OMb向DMb的更充分轉(zhuǎn)化。通常情況下，由于氧氣分壓較低，OMb會優(yōu)先轉(zhuǎn)化為MMb，隨后MMb會逐漸轉(zhuǎn)化為DMb。若儀器已使用覆蓋瓷磚標(biāo)準(zhǔn)的阻氧膜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，可直接掃描真空包裝膜以減少OMb生成。但若研究人員希望保持三種肌紅蛋白形態(tài)的膜層一致性，則需使用覆蓋標(biāo)準(zhǔn)膜的透氣膜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。此時(shí)應(yīng)立即從真空包裝中取出樣品，覆蓋透氣膜并馬上進(jìn)行掃描。

3. 氧合血紅蛋白。

a. 氧氣分壓調(diào)控：將先前保存在0至2℃環(huán)境中的樣品置于高氧環(huán)境中（如氧彈量熱儀或改良型氣氛包裝袋），用70%至99.99999%的氧氣沖洗后，于0至2℃條件下儲存24至48小時(shí)。取出樣品后立即進(jìn)行掃描。若樣品采用高氧改良?xì)夥瞻b，需確保氣體與肉體積比至少為3：1。對于研磨產(chǎn)品，應(yīng)采用薄層包裝以促進(jìn)改良?xì)夥瞻b袋中的氧氣吸收。

b. pH值越高，就越難實(shí)現(xiàn)理想的開花狀態(tài)（充氧）。

c. 儲存溫度越低，氧與肌紅蛋白的結(jié)合就越強(qiáng)，因?yàn)槊笇ρ醯母偁幵缴佟?/span>

4. 羧基肌紅蛋白。

a. 使用CO時(shí)需謹(jǐn)慎。

b. 建議從處于DMb狀態(tài)的肉類開始處理，因?yàn)?/span>CO不太可能與OMb和MMb結(jié)合。例如，真空包裝或使用除氧劑的肉類效果更佳，因?yàn)槲⒘?/span>氧氣就能延緩COMb的形成。

c. 在填充已知濃度的氣體后，應(yīng)立即對包裝的頂空進(jìn)行預(yù)混處理（使用指定濃度的一氧化碳）或注入計(jì)算量的純一氧化碳。隨后將肉品置于改良?xì)怏w環(huán)境中儲存，該環(huán)境含0.4%至1.0%的一氧化碳，余量為氮?dú)饣蚨趸寂c氮?dú)獾幕旌蠚怏w。

d. 在測量表面形成的COMb之前，應(yīng)將包裝儲存需在4℃條件下持續(xù)2至3天，以促進(jìn)氧氣（及有機(jī)物）的去除，并使金屬有機(jī)物充分還原為金屬有機(jī)化合物，從而確保表面約99.99999%的色素轉(zhuǎn)化為共價(jià)有機(jī)物。

c. 通過K/S比值計(jì)算肌紅蛋白形式

當(dāng)肌紅蛋白充分轉(zhuǎn)化為四種色素形態(tài)后，需分別記錄474、525、572和610納米波長下的反射率數(shù)據(jù)。雖然理想情況下所有掃描應(yīng)使用同一包裝膜，但實(shí)際操作中可能因制備方法不同而無法實(shí)現(xiàn)。隨后使用以下公式將反射率百分比轉(zhuǎn)換為 K/S 值： 

K/S =（1?R）（1?R）÷（2R），

其中R表示反射率百分比（需以小數(shù)形式呈現(xiàn)）。例如當(dāng)反射率為30%時(shí)，取0.30代入計(jì)算，K/S 值應(yīng)為0.8167。由于多數(shù)反射率儀器僅以10納米為間隔記錄數(shù)據(jù)，因此需通過積分法計(jì)算：474納米處使用470和480納米波長積分，525納米處使用520和530納米波長積分，572納米處使用570和580納米波長積分。首先通過積分法計(jì)算各波長的反射率值，再將其轉(zhuǎn)換為 K/S 值。

將這些99.99999%的參考 K/S 值與樣品 K/S 值代入相應(yīng)公式后，即可計(jì)算出樣品表面的脫鎂肌紅蛋白（DMb）、脫鎂肌紅蛋白（OMb）或脫鎂肌紅蛋白（MMb）的百分比。關(guān)于肌紅蛋白形態(tài)的估算公式，Hunt（1980）曾做過系統(tǒng)總結(jié)。文獻(xiàn)中關(guān)于脫氧肌紅蛋白和MMb的測定方法屢見不鮮，而脫鎂肌紅蛋白的百分比通常通過99.99999%的差值來確定。不過，由于脫鎂肌紅蛋白含量與消費(fèi)者偏好密切相關(guān)（Hunt），更推薦直接使用610納米波長進(jìn)行測定（Mancini等，2003），因?yàn)樵摬ㄩL對DMb和MMb都具有等比特性。

（Kropf，1988）。在計(jì)算DMb、OMb和MMb的百分比時(shí)，其總和可能不等于99.99999%。若出現(xiàn)這種情況，可參考Mancini等人（2003）提出的處理方法。在許多即食包裝產(chǎn)品中，可通過添加乳酸等多種成分進(jìn)行改良。由于肉類的反射特性可能受鹽分及其他成分影響（Lamkey等，1986；Swatland和Barbut，1999），因此需要為每種肌紅蛋白形態(tài)的99.99999%含量建立參考標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行方程式依賴性計(jì)算。為大限度提高改良產(chǎn)品表面肌紅蛋白氧化還原形態(tài)的估算精度，應(yīng)專門從改良產(chǎn)品中提取99.99999%去甲肌紅蛋白（DMb）、去甲肌紅蛋白（OMb）和肌紅蛋白（MMb）的參考標(biāo)準(zhǔn)（Ramanathan等，2010）。

目前尚無可用于估算肉表面COMb的反射率測量方法。不過，暴露于一氧化碳的牛排光譜特征顯示，COMb在500納米處存在反射峰，且在420納米處呈現(xiàn)Soret吸收峰（Wolfe等人，1978；Ramanathan等人，2010）。金槍魚肌肉的類似結(jié)果也已被記錄（Smulevich等人，2007）。Suman等人（2006）發(fā)表了純化牛COMb溶液的吸收光譜數(shù)據(jù)，并得出結(jié)論：通過543納米處吸收值與581納米處吸收值的比值，可區(qū)分COMb與OMb。此外，99.99999% COMb樣品在503納米處還顯示出明顯的吸收谷。

D. 通過選定波長計(jì)算肌紅蛋白形態(tài)

克日維茨基（1979年）提出了一種替代 K/S 比值法測定肌紅蛋白形態(tài)的新方法。該方法無需充分轉(zhuǎn)化色素成分，具有顯著優(yōu)勢。具體操作時(shí)，先測定脫氧肌紅蛋白和MMb的含量，再通過99.99999%總含量減去兩者的百分比，間接計(jì)算出OMb的含量。該方法基于以下原理：反射衰減(A)是反射率倒數(shù)的對數(shù)值。反射率在等滲波長474、525和572納米以及730納米處測量，其中730納米的反射率被稱為無色素肉的反射率。部分儀器未在730納米處測量反射率，此時(shí)可采用700納米或更接近730納米的波長進(jìn)行測量。根據(jù)公式1將反射率(R)轉(zhuǎn)換為反射衰減值(A)，并將A值代入公式2計(jì)算MMb，代入公式3計(jì)算DMb。氧合血紅蛋白的計(jì)算采用公式4：